BỆNH VIỆN
TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC

VAI TRÒ KHỬ CAN-XI VÀ CÁC DUNG DỊCH KHỬ CAN-XI TRONG KỸ THUẬT GIẢI PHẪU BỆNH MÔ XƯƠNG

      Giới thiệu

      Trong kỹ thuật giải phẫu bệnh giai đoạn xử lý và cắt mỏng mô là rất quan trọng, ảnh hưởng rất nhiều tới kết quả tiêu bản sau nhuộm. Bước xử lý mô để ổn định cấu trúc, giữ nguyên tính chất của mô, tế bào nhưng nó cũng phải đảm bảo các yếu tố dễ thao tác cũng như giảm độc hại cho kỹ thuật viên [1][2][4][5][10].

 

      Mô sinh thiết tủy xương có cấu trúc khác với các mô mềm khác, hiện diện nhiều xương nên rất cứng – do cấu trúc xương là các mạng tinh thể hydroxyapatite [Ca10(PO4)6(OH)2], chứa nhiều ion can-xi, photphat, kali, flourua... Để cắt mô sinh thiết tủy xương (với phương pháp xử lý như mô bình thường) thành lát mỏng cần lưỡi dao đặc biệt tráng kim cương hoặc Vonfram. Nhưng thao tác kỹ thuật vẫn rất khó khăn, tốn kém dao và chất lượng lát cắt cũng không cao (lát cắt dày mỏng không đều, dễ bong tróc mô trên lam…) . Vì vậy, cần thiết phải có bước khử Can-xi trong mô tủy xương sinh thiết trước khi tiến hành quá trình xử lý mô [12][1][2].

 

      Mục đích khử can-xi trong giải phẫu bệnh tủy xương sinh thiết:

- Làm mềm mẫu sinh thiết để có được các lát mỏng và toàn vẹn, tiết kiệm dao.

- Ảnh hưởng tới thời gian trả kết quả xét nghiệm

- Tác động không giống nhau tùy theo dung dịch tới các phương pháp nhuộm màu sau đó.

 

      Nguyên tắc khử can-xi

      Quá trình khử Can-xi thực chất là quá trình loại bỏ, thay thế các ion kim loại Can-xi trong cấu trúc của xương để làm mềm mô xương bằng các phản ứng hóa học. Có nhiều loại dung dịch Khử Can-xi khác nhau tuy nhiên về cơ bản chúng là các dung dịch acid.

 

      Dung dịch khử Can-xi : có 03 nhóm chính

      - Nhóm có thành phần Acid vô cơ mạnh: [3][6][16][17][12]

Gồm dung dịch có thành phần chính là các acid mạnh như Chlohidric, acid Nitric… Nhóm dung dịch này do tác động nhiều tới nhân, và các kháng nguyên của tế bào dẫn tới không thực hiện được các phương pháp sinh học phân tử trên tế bào. Chỉ nên dùng với các loại mẫu kích thước lớn, xương nhiều và mục đích nghiên chủ yếu là cấu trúc xương( mẫu răng, xương sọ...).

 
 

 

 

      Dung dịch Acid Nitric 5%: có tác dụng khử Can-xi rất nhanh, thời gian làm mềm mô rút ngắn (khoảng 2 – 4h). Nhưng lại có tác động mạnh mẽ tới Acid Nucleic nhân làm thay đổi cấu trúc của các thành phần trong nhân, dẫn tới chất nhuộm màu nhân Hematoxylin trong phương pháp nhuộm H&E gắn kết khó và kém với nhân. Màu nhân không ổn định bác sĩ Giải phẫu bệnh rất dễ nhầm lẫn ảnh hưởng trực tiếp tới kết quả xét nghiệm .

 

      Mặt khác pH acid tác động mạnh mẽ tới phân bố và số lượng các vùng ưa bazo (-NH2), vùng ưa acid (-COOH) trên các Protein trên màng và bên trong của tế bào. Tác động này làm thay đổi hình dạng cấu trúc của các Protein đó qua đó các Epitope trên protein bị biến đổi. Dẫn tới nhuộm Hóa mô miễn dịch không còn đặc hiệu, hoặc giảm khả năng liên kết dẫn tới biểu hiện màu không chính xác.

 

      Dung dịch acid Chlohidric 5-10%: có tác dụng khử Can-xi rất nhanh ( khoảng 1- 1.5 giờ), mẫu mô mềm giống như các mô mềm khác rất dễ thực hiện thao tác cắt mỏng. Nhưng tác động rất mạnh tới nhân dẫn tới bắt màu kém, một số dấu ấn kháng nguyên không biểu hiện màu ( âm tính giả), một số dấu ấn có biểu hiện màu nhưng tỷ lệ tế bào dương tính giảm (âm tính giả một phần), chất lượng bắt màu giảm( không đặc hiệu, nhòe). Acid chlohidric độc hại đối với người sử dụng do dung dịch chlohidric tác dụng với Formalin tồn dư trong tế bào của quá trình cố định mô.

 

      Dung dịch acid Chlohidric 5% + acid Formic 5%: có tác dụng khử Can-xi nhanh ( khoảng 2 giờ), mẫu mô mềm giống như các mô mềm khác rất dễ thực hiện thao tác cắt mỏng, tác động không quá nhiều trong nhuộm hai màu Hematoxylin, Eosin. Nhưng tác động làm một số dấu ấn kháng nguyên không biểu hiện màu ( âm tính giả), một số dấu ấn có biểu hiện màu nhưng tỷ lệ tế bào dương tính giảm (âm tính giả một phần), chất lượng bắt màu giảm( không đặc hiệu, nhòe).

 
 

 

 

      - Nhóm có thành phần Acid hữu cơ yếu:

      Gồm các dung dịch có thành phần chủ yếu là các acid yếu Acid Formic, acid Piric, acid Acetic,…, và các dung dịch hỗn hợp của các acid yếu với các muối đệm.

 

      Những dung dịch này có tác dụng khử Can-xi chậm hơn các acid vô cơ mạnh. Thời gian làm mềm mô dài hơn (khoảng 6 – 12h). Nhưng các dung dịch này ít tác động tới Acid Nucleic và các thành phần trong nhân hơn. Hematoxylin bắt màu tốt hơn, giúp bác sĩ có thể phân tích tốt hơn.

 

      Những dung dịch acid yếu thời gian khử Can-xi dài sự biến động chỉ số pH của dung dịch thay đổi dẫn tới mẫu mô sau khử Can-xi có tác động đáng kể. Để khắc phục nhược điểm này người ta pha thêm vào dung dịch khử Can-xi các muối của các acid yếu để tạo các dung dịch đệm nhằm ổn định pH của dung dịch trong suốt quá trình (Các dung dịch của acid Formic với Sodium citrat, Sodium formate, hay với Formalin …).

 

      Dung dịch acid Formic 10%, Dung dịch acid Formic 15% + 10% sodium citrat, Dung dịch acid Formic 18% + 3.5% sodium formate: một số dung dịch acid yếu hay được sử dụng trong khử Can-xi của một số phòng thí nghiệm trên thế giới. Các dung dịch này là acid yếu hoặc acid yếu và muối đệm nên trị số pH khá ổn định trong suốt quá trình khử. Phần lớn các nghiên cứu về các dung dịch này đều khẳng định chúng đều không tác dụng quá nhiều đến cấu trúc nhân, kháng nguyên tế bào. Nhưng thời gian khử can-xi thì khá dài 12 – 18 giờ.

 

      Dung dịch AFF (Acid Formic 25ml +Formalin 5ml +Nước cất 75ml): có tính chất của một dung dịch đệm pH ổn định trong suốt quá trình khử Can-xi . Acid Formic trong AFF ngoài tác dụng khử Can-xi còn có tác dụng giống như chất xúc tác rút ngắn thời gian tạo các liên kết Methylen để cố định mô. Formalin trong AFF ngoài tác dụng tạo dung dịch đệm để ổn định pH, tiếp tục cố định mô còn có tác dụng dẫn dắt Acid Formic thấm nhanh và đều hơn vào trong mô, tăng hiệu quả của Acid Formic. Sự kết hợp hoàn hảo loại bỏ đi nhiều nhược điểm của dung dịch bản chất acid yếu của dung dịch AFF. AFF có thời gian làm mềm mô ở mức trung bình nhiều hơn acid vô cơ mạnh nhưng nhanh hơn các acid hữu cơ khác, đồng thời giảm thời gian cần thiết phải cố định mô trước khi khử Can-xi xuống còn 4 – 6 giờ thay vì 8 giờ trở lên . Với hai ưu điểm này rút ngắn đáng kể thời gian hoàn thành xét nghiệm khi khử Can-xi bằng dung dịch acid hữu cơ yếu khác [1][3].

 

      - Nhóm hợp chất khác:

      Ngoài các dung dịch trên còn có các dung dịch muối EDTA (Dung dịch EDTA 17%, EDTA disodium 15%):

 

      Các dung dịch này bắt từ từ các Ion can-xi để làm mềm mô. Phản ứng diễn ra chậm nhưng ổn định ít tác hại. Dung dịch được điều chỉnh ổn định về pH trung tính bằng các muối đệm, tạo trạng thái cân bằng ổn định nhất để bảo vệ mô và các thành phần tế bào. Quá trình khử Can-xi diễn ra ổn định nên tiêu bản của những mẫu mô khử Can-xi bằng EDTA nhuộm màu rất tốt với tất cả các phương pháp nhuộm. Ưu điểm ổn định và chất lượng cao nhưng thời gian thực hiện lại quá dài (Khử Can-xi khoảng 48 – 72 giờ), mặt khác trước khi Khử Can-xi mô phải được cố định đủ lâu trong Formalin Buffer [3][7][11][14]. Vì vậy các dung dịch này nên dùng trong nghiên cứu khoa học và các đơn vị không cần có kết quả sớm.

 

      Kết luận

      Chẩn đoán Giải phẫu bệnh hiện nay không chỉ dựa trên quan sát hình thái mà còn cần các kỹ thuật miễn dịch, phân tử mới như hóa mô miễn dịch (IHC), lai tại chỗ (FISH, SISH, SGH); đây là những kỹ thuật cao yêu cầu sử dụng các loại dung dịch cố định bệnh phẩm, dung dịch khử Can-xi và quá trình xử lý mô phù hợp có thể bảo tồn các Acid Nucleic, Protein, các Epitope bề mặt, cũng như bên trong tế bào. Với sự phát triển đó, nhu cầu thay đổi hóa chất xử lý để nâng cao chất lượng bảo quản mô rất cần thiết.

 

      Các trung tâm xét nghiệm giải phẫu bệnh trên thế giới đã sử dụng nhiều loại dung dịch khử Can-xi và có rất nhiều nghiên cứu so sánh, đánh giá hiệu quả của các loại dung dịch trên với nhau. Chúng tôi tóm tắt lại một số nghiên cứu để chúng ta có thể lựa chọn loại dung dịch khử Can-xi phù hợp nhất với nhu cầu, điều kiện của từng phòng xét nghiệm.

 

      TÀI LIỆU THAM KHẢO:

[1] Andriko J A, Swerdlow S H, Aguilera N I. et al Is lymphoplasmacytic lymphoma/immunocytoma a distinct entity? A clinicopathologic study of 20 cases. Am J Surg Pathol 2001.

[2] Brown R S, Edwards J, Bartlett J W. et al Routine acid decalcification of bone marrow samples can preserve DNA for FISH and CGH studies in metastatic prostate cancer. J Histochem Cytochem 2002.

[3] Emina Emilia Torlakovic, Kikkeri N Naresh, Richard D Brunning. Bone Marrow Immunohistochemistry. American Society for Clinical pathology 2008.

[4] Fend F, Bock O, Kremer M. et al Ancillary techniques in bone marrow pathology: molecular diagnostics on bone marrow trephine biopsies. Virchows Arch 2005. 447909–919.919.

[5] Gala J L, Chenut F, Hong K B. et al A panel of antibodies for the immunostaining of Bouin's fixed bone marrow trephine biopsies. J Clin Pathol 1997. 50521–524.524.

[6] K N Naresh, I Lampert, R Hasserjian. et al Optimal processing of bone marrow trephine biopsy: the Hammersmith Protocol J Clin Pathol. 2006 September.

[7] Kremer M, Quintanilla, Martinez L, Nahrig J. et al Immunohistochemistry in bone marrow pathology: a useful adjunct for morphologic diagnosis. Virchows Arch 2005.

[8] Machado-Silveiro LH, Gonzalez-Lopez S, Gonzalez - Rodriguez MP. Decalcification of root canal dentin by citric acid, EDTA and sodium citrate. International Endodontic Journal. 2004.

[9] Mawhinney WH, Richardson E, Malcolm AJ. Control of rapid nitric acid decalcification. J Clin Pathol 1984;37:1409-13.

[10] McCluggage W G, Roddy S, Whiteside C. et al Immunohistochemical staining of plastic embedded bone marrow trephine biopsy specimens after microwave heating. J Clin Pathol 1995.

[11] Milan L, Trachtenberg M C. Ultrasonic decalcification of bone. Am J Surg Pathol 1981.

[12] Mullink H, Henzen Logmans S C, Tadema T M. et al Influence of fixation and decalcification on the immunohistochemical staining of cell specific markers in paraffin embedded human bone biopsies. J Histochem Cytochem 1985.

[13] Roli Bhatnagar, Dhanya Kumar N. M. Vasundhara Shivanna. Decalcifying Effect of Three Chelating Agents College Of Dental Sciences, Davangere.

[14] Scelza MFZ, Teixeira AM, Scelza P. Decalcifying effect of EDTA-T, 10% Citric acid and 17% EDTA on root canal dentin. Oral Surgery Oral Medicine Oral pathology. 2003

[15] Singh S, Sircar K. Evaluation of efficacy of various chemicals for decalcification of dental hard tissues - An in-vitro study. J Orofac Sci 2010;1:5-10.

[16] Wickham C L, Sarsfield P, Joyner M V. et al Formic acid decalcification of bone marrow trephines degrades DNA: alternative use of EDTA allows the amplification and sequencing of relatively long PCR products. Mol Pathol 2000.

[17] Zappa J, Cieslik-Bielecka A, Adwent M, Cieslik T, Sabat D. Comparison of different decalcification methods to hard teeth tissues morphological analysis. Dent Med Probl 2005;42:21-6.



LÊ THANH TÚ

LÊ THANH TÚ

TIN KHÁC